Состояние глутатионового звена антиоксидантной системы крови практически здоровых людей с лор-патало...

Красноярск 2008

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений. 3

Введение. 4

Глава 1. Обзор литературы.. 6

1.1. Уровень антропогенной нагрузки на здоровье населения в условиях промышленного города. 6

1.2. Активные формы кислорода: свойства и механизмы образования. 9

1.3. Характеристика антиоксидантной системы.. 15

Глава 2. Материалы и методы.. 24

2.1. Объект исследования. 24

2.2. Приготовление эритроцитов. 25

2.3. Определение содержание гемоглобина. 25

2.4. Определение количества восстановленного глутатиона…………………26

2.5. Определение активности глутатионпероксидазы.. 28

2.6. Определение активности глутатион-S-трансферазы.. 29

2.7. Определение активности глутатионпероксидазы.. 30

2.8. Статистическая обработка результатов. 32

Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение. 33

3.1. Анализ содержания GSH и активности глутатионзависимых ферментов в эритроцитах крови практически здоровых людей и людей с ЛОР-заболеваниями. 33

3.2. Анализ содержание GSH и активность глутатионзависимых ферментов в эритроцитах крови практически здоровых людей, проживающих в различных по уровню загрязнения районах г.Красноярска. 37

3.3. Анализ содержание GSH и активность глутатионзависимых ферментов в эритроцитах крови здоровых мужчин и женщин. 40

3.4. Содержание GSH и активность глутатионзависимых ферментов в эритроцитах крови практически здоровых людей различного возраста. 41

Выводы.. 44

Список литературы.. 45

Summary. 52

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК – активные формы кислорода

АОС – антиоксидантная система

ДНК – дезоксинуклеиновая кислота

КрАЗ – Красноярский Алюминиевый Завод

ПОЛ – перекисное окисление липидов

ПДК – предельно допустимая концентрация

РНК – рибонуклеиновая кислота

ТЭЦ – топливо-энергитический центр

цАМФ – цикло-аденозинмонофосфат

GSH – восстановленный глутатион

GPO – глутатионпероксидаза

GR – глутатионредуктаза

GST – глутатион-S-трансфераза

NADP – никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный

NADFH – никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный

СРО – свободнорадикальное окисление

NRF – ядерный респираторный фактор

ВЕДЕНИЕ

В последние десятилетия в связи с огромным развитием промышленности экология индустриальных городов значительно ухудшилась, это результат больших техногенных выбросов предприятий стоящих на территории городов или вблизи них [Иванова с соавт., 2001].

По степени загрязнения атмосферы город Красноярск входит в число наиболее загрязненных городов Российской Федерации. На территории города располагаются крупные предприятия, которые являются основными поставщиками загрязняющих веществ в атмосферу города, к таким предприятиям относятся две ТЭЦ, алюминиевый, цементный, целлюлозно-бумажный, фармацевтический заводы [Симонова, 2002]. Только ОАО «Красноярский Алюминиевый завод» имеет объемы выбросов в атмосферу в размере 58,6 тыс. в год. Основными компонентами химического загрязнения окружающей среды от КрАЗа являются: фтористый водород, плохорастворимые неорганические фториды, оксиды алюминия, оксид углерода бенз(а)пирен, сернистый ангидрид [Игамбердиев, 2004]. Превышение ПДК наблюдается по фторидам газообразным - до 2,79 раз; по бенз(а)пирену – до 4,42 раз; по плохо растворимым фторидам – до 3,16 раз. При этом уровень загрязнения атмосферы жилой зоны города по фторидам газообразным составил 1,19-1,57 ПДК на 2003 год [Реброва, 2003]

По данным ряда авторов фтор и его производные в умеренных дозах является необходимым элементом живых организмов, наибольшее его содержание отмечено в зубах и костях, низкие концентрации – повышают устойчивость зубов к кариесу, стимулируют кроветворение, репаративные процессы при переломах костей и реакции иммунитета, участвуют в росте скелета, избыточное поступление фтора в организм вызывает флюороз. При ингаляционном поступлении в организм газообразных соединений фтора и содержащих фтор аэрозолей возникают атрофические изменения слизистой оболочки верхних дыхательных путей и бронхов, возможно развитие ринита, фарингита, ларингита [Богданов, Гембицкий, 1975].

Дыхательная система является входными воротами для попадания в организм поллютантов техногенного происхождения. Действия пылевых частиц на респираторные органы вызывает образование большого числа активных форм кислорода (АФК), и приводят к развитию окислительного стресса. Антиоксидантная система осуществляет защиту организма от пагубного действия прооксидантов и ограничивает развитие окислительного стресса [Ковальчук, 2004].

ЦЕЛЬ: оценить состояние глутатионового звена антиоксидантной системы в эритроцитах крови практически здоровых людей и людей с ЛОР-заболеваниями, проживающих в различных по уровню загрязнённости районах города Красноярска.

ЗАДАЧИ РАБОТЫ:

1. Изучить содержание GSH и активность GPO, GST и GR в эритроцитах крови практически здоровых людей и людей с хроническим ЛОР-заболеваниями.

2. Определить содержание GSH и активность GPO, GST и GR в эритроцитах крови практически здоровых людей проживающих в различных по уровню загрязнения районах г. Красноярска.

3. Провести сравнительный анализ содержания GSH и активности GPO, GST и GR в эритроцитах крови практически здоровых мужчин и женщин.

4. Выяснить содержание GSH и активность глутатионзависимых ферментов в эритроцитах крови практически здоровых людей различного возраста, проживающих в районах с разной техногенной нагрузкой г. Красноярска.

Работа выполнена на базе кафедры биохимии и физиологии человека и животных Института фундаментальной биологии и биотехнологии Сибирского федерального университета.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Уровень антропогенной нагрузки на здоровье населения в условиях промышленного города

Анализ исследований за последнее десятилетие показал, что атмосферный воздух загрязняется вследствие образования загрязняющих веществ в концентрациях, превышающих нормативы качества или уровня естественного содержания. Мощность антропогенного воздействия на атмосферу увеличивается с каждым годом. За последние 25 лет ее техногенная запыленность возросла на 70%. Ежегодно, в результате деятельности человека, в атмосферу выбрасываются миллионы тонн загрязняющих веществ: диоксиды серы, оксидов азота, углерода, хлорфторуглероды (фреоны), которые отрицательно действуют на физико-химические свойства атмосферы и на здоровье людей [Пинигин, 1991; Новиков,1999].

Наиболее активными поставщиками поллютантов – веществ, загрязняющих атмосферу, являются автомобили, коксохимические, цементные, нефтеперерабатывающие, сталеплавительные, целлюлозобумажные, металлургические заводы, ТЭЦ, то есть отрасли, без процветания которых современный человек не мыслит своего существования [Онищенко, 2003].

Практически каждый поллютант является высокотоксичным веществом, постепенно разрушающим здоровье человека. Так, например, при сгорании угля и мазута выделяется двуокись серы, она вызывает легочные и аллергические заболевания, окись углерода, образующаяся при сгорании всех видов топлива, поражает сердечно-сосудистую систему, углеводороды, содержащиеся в выхлопных газах автомобилей, канцерогены, пылевидные отходы (цементный завод выбрасывает около 15 тонн пыли в сутки) провоцирует развитие бронхиальной астмы, заболеваний легких [Савин, 2001].

Как известно, человек подвержен экологическому влиянию не только в широком смысле понимания этого термина как окружающей человека среды, но и непосредственно во время его производственно - профессиональной деятельности. Трудовая деятельность человека не только ухудшает качество среды, но и обеспечивает условия труда, которые, являясь существенным фактором части окружающей среды (производственной среды), зачастую оказывают негативное влияние на работающего человека [Haglof, 2003]. Абсолютные величины предельно допустимых концентраций (ПДК) одних и тех же веществ в воздухе рабочей зоны от нескольких десятков до нескольких тысяч раз выше среднесуточных ПДК для атмосферы [Кучма, 2002]. Поэтому суммарная нагрузка вредными веществами на рабочего во столько же выше по сравнению с нагрузкой на население в целом. Наиболее распространенным профессиональным заболеванием рабочих алюминиевого производства является хроническая фтористая интоксикация – профессиональный флюороз, который составляет 70 % всех профессиональных заболеваний в данной области [Коцнельсон с соавт., 2000]. Обязательным проявлением профессионального флюороза является не только остеосклероз, но и дегенеративно-дистрофические изменения опорно-двигательного аппарата по существу возрастного характера, что развиваются они намного раньше и носят не только двухсторонний, но и симметричный характер. Явно опережающей хронологические сроки наступление кардинального признака старения (вероятности смерти по мере взросления) является и демографическая ситуация. Так продолжительность жизни рабочих алюминиевого завода составляет около 44 лет. Сроки развития профессионально флюороза зависят в большей степени от возраста начала работы в контакте с фтористыми соединениями и мышечных нагрузок [Гичев, 2002].

Изучение закономерностей формирования здоровья населения, проживающего в зоне влияния выбросов алюминиевых производств, остается актуальной гигиенической задачей. Как известно, основными вредными факторами алюминиевого производства является фтор, его соли и фтористый водород. По данным ряда авторов уровень загрязнения атмосферного воздуха фтористыми соединениями в зоне влияния выбросов алюминиевого завода превышает ПДК в 1,6-2,1 раза. Фтористые соединения так же обнаруживаются в воде и почве и превышают контрольные в 5 раз [Иванова с соавт., 2001]. Токсичные соединения фтора в значительном количестве поступают через дыхательные пути, с продуктами питания, питьевой водой. Имеется ряд исследований о влиянии фтористых соединений на состояние перекисного окисления липидов мембран клеток и антиоксидантной защиты [Cavalca, et al., 2001]. Длительное воздействие на организм токсичных соединений фтора, фтористоводородной кислоты приводит к формированию выраженных функционально-структурных нарушений, к угнетению биоэнергетического обмена в эритроцитах, белково-образовательной функции печени, усилению пролиферативно-клеточной реакции. Высокая реакционность фтора делает возможным его проникновение через защитные барьеры организма, нарушая целостность мембран, усиливая процессы липопероксидации. Результаты ряда исследований свидетельствую о том, что фтор и его соединения вызывают системное поражение организма, которое проявляется рядом специфических заболеваний [Кацнельсон с соавт., 2000].

В литературе приводятся данные, что для интоксикации фтором характерно разнообразное воздействие на обменные процессы. Этот элемент обладает высоким сродством к некоторым элементам, например, кальцию и магнию, с которыми он комплексуется в клетке [Мамырев, Богатова, 2002]. Фтор способен выступать в качестве регулятора ферментативной активности в клетке. Он обладает ингибирующим действием на металлопротеины. Это, по-видимому, обусловлено тем, что он представляет собой один из наиболее “жестких” лигандов, то есть, способен образовывать прочные комплексы с ионами “жестких” металлов, к которым относятся почти все металлы в биологических системах [Генкин, Глотов, Ждахина, 1983]. В силу этого обстоятельства при увеличении концентрации фтор способен “вклиниваться” в структуру биокоординационных соединений и замешать некоторые ионы-лиганды (например, гидроксил-ионы), в результате чего изменяется конформация соединения, что и приводит к “ухудшению” взаимодействия фермента с субстратом, то есть к ингибированию ферментативной активности [Ройт,1991]. Наибольшей прочностью отличается соединение фтора с ионами магния, в силу чего большинство Мg2+-зависимых ферментных систем по своей чувствительности к ингибирующему воздействию фтора в несколько раз превосходят ферменты, активируемые другими ионами, например Мn2+.Существуют данные о влиянии фтора на активность некоторых энзимов, например липаз, через их лабильный компонент – кофермент [Разумов, 1997]. Из литературных источников известно, что фтор способен оказывать ингибирующее влияние на ферменты цикла трикарбоновых кислот и цепи переноса электронов: НАДН- зависимые дегидрогеназы, цитохромоксидазу, сукцинатдегидрогеназу, a-кетоглутаратдеги-дрогеназу. Наибольшей чувствительностью из них к фтору обладает сукцинатдегидрогеназа [Abiaka, 2000].

1.2. Активные формы кислорода: свойства и механизмы образования

Обязательным атрибутом нормальной аэробной жизни является генерация АФК – прооксидантов. Функционирование и развитие клеток не могло быть возможным без существования защитных систем, к которым относиться специализированные ферментативные и неферментативные актиоксиданты [Меньщикова c соавт, 2006]. Постоянное образование прооксидантов уравновешенно их дезактивацией антиоксидантами, поэтому для поддержания гомеостаза необходимо непрерывная генерация антиоксидантной способности. Отсутствие или сбой этой непрерывности приводят к развитию окислительного стресса, к возникновению и накоплении окислительных повреждений, что сопровождает ряд физиологических процессов – таких как воспаление, реперфузионное поражение тканей, бронхо-легочное заболевание, старение и др.

В живых организмах существует два разных источника АФК: радикальные окислительные реакции и металопротеиновые ферментативные системы. В обоих случаях молекулярный кислород выступает акцептором электронов. Наличие у молекулярного кислорода двух неспаренных электронов существенно ограничивает его реакционную способность. В процессе эволюции у живых организмов выработались специальные ферментативные системы, которые восстанавливают молекулярный кислород, перенося на него один, два или четыре электрона. Главные ферменты, которые осуществляют метаболизм кислорода в организме млекопитающих – оксидазы и оксигеназы. В активных центрах этих ферментов кислород превращается в этих продуктах и не выходит в окружающую среду, но при этом они не подвергают опасности органические молекулы, а опасными являются активные формы кислорода, которые образуются как побочные вещества в ходе этих превращений [Меньщикова c соавт, 2006].

Главные АФК: супероксидный радикал , перекись водорода , гидроксильный радикал , синглетный кислород , гипогалоиды алкоксильный радикал и перекисный радикал .

Характеристика основных форм АФК

Супероксидный радикал. Присоединение одного электрона к молекуле кислорода в основном состоянии приводит к образованию супероксидного анион радикала (), который при взаимодействии с протоном переходит в гидроперекисный радикал () [Бурлакова с соавт., 1992]. В живых системах супероксидный анион является промежуточным продуктом многих биохимических реакций – окисление тиолов, флавинов, хинонов, катехоламинов, птеринов, ксонобиотиков. Но основные источники его образование – ферментативные системы: NADFH-оксидаза фагоцитирующих клеток, ксантиноксидаза, митохондриальная цитохром-с-оксидаза и микросомальные монооксигеназы. При активации фагоцитов в очаге воспаления генерация  служит пусковым звеном целого каскада реакций, приводящих к образованию других форм АФК. Для регуляции уровня  в клетках служит высокоспецифичный фермент – антиоксидант супероксиддисмутаза, которая существенно ускоряет реакции дисмутации  до перекиси водорода [Зенков, Меньщикова, 2004].

Перекись водорода. Присоединение двух электронов к молекуле кислорода или одного электрона к аниону  сопровождается образованием двухзарядного аниона , который в свободном состоянии не существует, присоединяя протоны он переходит в гидроперекисный анион  [Brune, Messmer, 1995]. Перекись водорода – слабый окислитель, в отсутствии каталазы и ионов металлов переменной валетности она относительно стабильна и может мигрировать в клетке и ткани. В живых организмах источниками  служат ферментативные реакции с оксидазами, реакция дисмутации, катализируемая SOD [Зенков, Меньщикова, 2004].

Клетки млекопитащих достаточно устойчивы к воздействию , благодаря наличию глутатионпероксидазной и каталазной ферментативных систем, первая из которых эффективно работает при малых концентрациях перекиси, вторая – при высоких.

Гипогалоиды. Образуются главным образом в результате ферментативной реакции перекиси водорода с галидами, катализируемой миелопероксидазой, пероксидазой эозинофилов, которые различаются по структуре и субстратной специфичности. Основным продуктом миелопероксидазы является , пероксидаза эозинофилов катализирует образование и. Гипогалоиды инактивируют -антитрипсин, переводят коллагеназу в активную форму Б, окисляют лейкотриены, иммуноглобулины, альбумин, церулоплазмин, трансферрин. Вызывают структурную модификацию и инактивацию ,-SOD могут как индуцировать, так и ингибировать процессы ПОЛ.

Гидроксильный радикал является наиболее реакционноспособным АФК, образующимся в биологических системах, он может разрывать любую углеродную связь [Андреев, 1999]. Образование ОН-радикала показано в реакциях окисления арахидоновой кислоты, в реакции Габера-Вейса, при микросамальном окислении, в реакциях с флавиновыми ферментами и убихиноном, но основным источником OH-радикалов в биологических системах служит реакция Фентона с участием металлов переменной валентности, главным образом :

Обратное восстановление  возможно в реакции с :

а также при взаимодействии с аскорбиновой кислотой, глутатионом, цистеином и другими окисляющимися соединениями [Зенков, Меньщикова, 2004].

Синглетный кислород. В кислороде внутримолекулярно происходит перестройка электронов и возникает более высокий энергетический уровень [Владимиров, 1998]. Источником синглетного кислорода являются реакции фотосенсибилизированного окисления биологических субстратов, при не фотохимических реакциях не ферментативная дисмутация супероксидных радикалов, протекающие с образованием перекиси водорода.  обладает высокой химической активностью, особенно по отношению к молекулам, содержащим участки повышенной электронной плотности.

Алкоксильные и перекисные радикалы. При развитии радикальных окислительных процессов взаимодействие органических радикалов молекулярным кислородом приводят к образованию перекисных радикалов, которые с алкоксильными радикалами  могут образовываться в реакциях разложения перекиси в присутствии ионов металлов переменной валентности. По физико-химическим свойствам алкоксильные и перекисные радикалы это очень гетерогенный класс соединений, включающий высокореакционный OH-радикал и мало активные радикалы фенольных антиоксидантов. Взаимодействие  и  с углеводородами, приводящие к образованию и  - это наиболее медленная стадия развития радикальных окислительных процессов [Владимиров, 1998].

Биологический эффект и  реализуется через повреждающее действие на белки, ферменты, нуклеиновые кислоты, через продукты ПОЛ – органические перекиси, альдегиды, кетоны, эпоксиды, которые высокотоксичны для клеток. Ингибиторы – аскорбиновая кислота, мочевая кислота, убихинон, селен, -токоферол [Андреев, 1999].

Все формы АФК обладают высокой цитотоксичностью для клеток и клеточных образований. Можно выделить четыре мишени окислительной цитотоксической атаки АФК: индукция процессов ПОЛ в биологических мембранах, повреждение мембрансвязанных белков, инактивация ферментов и повреждение ДНК клеток.

Аминокислоты, из которых состоят белки, подвержены окислительному действию АФК, что приводит к трем вариантам изменения физико-химических свойств белков: фрагментации, агрегации и повышению чувствительности к протеолизу. В первую очередь воздействию кислородных радикалов подвергаются остатки пролина гистидина и аргинина. Окислительное повреждение приводит к денатурации и агрегации белков (хрусталика глаза). Агрегация белков связана со способностью АФК образовывать межмолекулярные сшивки. В результате денатурации белков нарушается их конформация, и они становятся более уязвимыми к действию протеолитических ферментов [Зенков, Меньщикова, 2004].

Окислению АФК в первую очередь подвергаются SН-содержащие группы белков; их окисление приводит к снижению содержания восстановленных и повышению уровня окисленных SН-групп, поэтому соотношение окисленных и восстановленных SН-групп белков может быть использовано в качестве показателя развития окислительного стресса. Наиболее подвержена окислительному стрессу Са2+-АТФаза, ее повреждение приводит к нарушению транспорта кальция через мембрану [Владимиров, 1999].

Карбонильные группы и гидроперекиси, образующиеся при окислении белков, также является показателем свободнорадикального окисления.

Окисление липидных молекул приводит к необратимому изменению мембранных структур, нарушению их проницаемостью для ионов. Наиболее подвержены перекисному окислению входящие в состав мембран ненасыщенные жирные кислоты: линолевая, арахидоновая, докозагексаеновая [Козлов, 2006]. Одним из важнейших следствий избыточного образования АФК является избыточная и неконтролируемая в этих условиях активация процессов ПОЛ. Процессы ПОЛ можно условно подразделить на три последовательных этапа, или фазы развития: процессы зарождения цепей, процессы развития цепных реакций и обрыв цепей. На стадии зарождения цепей под действием свободных радикалов кислорода, ионизирующей радиации, ультрафиолетового облучения и ряда химических веществ, относящихся к прооксидантам, происходит образование органических радикалов (R).

На следующей стадии радикал быстро взаимодействует с кислородом, который выступает в качестве акцептора электронов. В результате происходит образование пероксирадикала (RО2), который атакует ненасыщенные липиды. Возникновение в результате этой реакции органических перекисей и нового радикала (R) способствует продолжению окислительных реакций, приобретающих цепной характер:

R + О2 RО2

Органические перекиси (RООН) включаются в процесс генерации радикалов, в присутствии металлов переменной валентности (меди, кобальта, марганца, железа) происходит образование реакционного алкоксильного радикала:

Часть образующихся органических радикалов взаимодействует друг с другом, при этом происходит образование неактивных молекул, что обрывает ход реакций свободнорадикального окисления. Гидроперекиси липидов способны подвергаться нерадикальным окислительным превращениям, что приводит к образованию первичных (диеновые коньюгаты, диальдегиды), промежуточных (основания Шиффа) и конечных продуктов ПОЛ, а также спиртов, кетонов и альдегидов. Обрыв цепных реакций перекисного окисления возможен при взаимодействии радикалов со специализированными ферментными системами, а также с рядом низкомолекулярных веществ, совокупно формирующих биохимический компонент антиоксидантной системы организма [Меньщикова с соавт., 2006].

Одним из конечных продуктов ПОЛ является насыщенные низкомолекулярные углеводороды (этан, гексан, пентан), которые в нормальных условиях переходят в газообразное состояние.

Идентифицировано более 20 типов окислительных повреждений молекул нуклеиновых кислот: различные повреждение оснований, возникновение одно- и двух цепочечных разрывов, сшивок и хромосомных аберраций. Прямое действие и  на ДНК не вызывает повреждения оснований или образования сшивок между основаниями. Основным повреждающим агентом выступает OH-радикал, который эффективно взаимодействует с дезоксирибозой, пуриновыми и пиримидиновыми основаниями. Синглетный кислород более специфично, чем , взаимодействует с гуанином. Перексинитрит вызывает нитрозилирование и дезаминирование аминогрупп в основаниях ДНК, при этом 8-нитрогуанин является индикатором повреждающего действия пероксинитрита. В условиях окислительного стресса в наибольшей степени повреждается ДНК митохондрий, что связано с низкой активностью систем репарации и низким содержание гистоновых белков, оказывающие защитное действие [Зенков, Менщикова, Шергин, 1993].

1.3. Характеристика антиоксидантной системы

В процессе эволюции в клетках для защиты от АФК выработались специализированные системы: ферментативная антиоксидантная система (АОС) и неферментативная АОС. В качестве неферментативной АОС могут выступать: жирорастворимые антиоксиданты (витамин Е, β-каротин, убихиноны) [Абрамова, 2004], водорастворимые (аскорбат, рутин, глутатион). Гидрофобные антиоксиданты локализованы в биомембраннах, гидрофильные - в цитозоле клетки.

Ферментативная АОС включает: супероксиддисмутазу (SОD), катализирующую реакцию дисмутации О2ˉ в Н2О2, каталазу (CАТ), разлагающей Н2О2, глутатионпероксидазу (GPO), глутатион-S- трансферазу (GSТ), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу (G6FD), глутатионредуктазу (GR), глутатионзависимые ферменты удаляют органические перекиси [Брискин, Рыбаков 2000].

Супероксиддисмутаза имеет несколько изоферментных форм, различающихся строением активного центра. Медь-цинковая форма чувствительна к цианиду и содержится в цитозоле и межмембранном пространстве митохондрий клеток эукариот, марганецсодержащая форма локализована в митохондриях клеток эукариот, а так же бактерий, экстрацеллюлярная высокомолекулярная форма SOD (Э-SOD) [Биленко,1999]. Э-SOD обладает высоким сродством к гепарину и хорошо связывается с гепаринсульфатом гликокаликса эндотелиоцитов. Нативная форма SOD выдерживает нагревание при 100ºС в течение одной минуты, устойчив к колебаниям значений pН в широком диапазоне. SOD существенно ускоряет реакцию дисмутации О2ˉ, обрывая тем самым опасную цепь свободнорадикальных превращений кислорода:

О2ˉ + О2ˉ → H2O2 + O2

HO + HO. → H2O2 + O2

HO.2 + Н+ → H2O2 + O2

В определенных условиях медьсодержащая форма SOD может взаимодействовать с перекисью водорода и выступать в качестве прооксиданта, инициируя образование радикалов – супероксида и гидроксила:

Cu2+-СОД + H2O2 ←→ Cu+-СОД + 2Н+ + О2ˉ

Cu+-СОД + H2O2 ←→ Cu2+-СОД + ОН. + ОН+

СОД играет важную роль в защите клеток от действия супероксид-анион радикала, стабилизирует клеточные мембраны, предотвращая процессы ПОЛ, снижая уровень О2ˉ, она защищает от его дезактивирующего действия CAT и GPO [Александров,2007].

Регулирующее влияние на активность SOD оказывают глутатион, цистеин, другие SH-содержащие соединения, а также опосредованно ферменты глутатионового обмена [Зенков, Меньщикова, 2004].

Каталаза – фермент, участвующий в детоксикации нерадикальной активной формы кислорода – Н2О2. Эта гемсодержащий фермент, локализованный преимущественно в пероксисомах клеток. Большая молекулярная масса фермента препятствует его проникновению через клеточную мембрану [Биленко, 1999]. Разложение Н2О2 каталазой осуществляется в два этапа.

CAT + Н2О2 → CAT - Н2О2

CAT - Н2О2 + Н2О2 → CAT + 2Н2О + О2

При этом в окисленном состоянии каталаза работает и как пероксидаза, катализируя окисление спиртов или альдегидов:

CАТ - Н2О2 + >CHOH → CАТ + 2Н2О + >C=O

Каталаза ингибируется азидом, цианидом, пероксидом водорода в высоких концентрациях и некоторыми органическими гидроперекисями. Каталаза может выступать источником образования АФК. 0,5% кислорода, образующегося в результате разложений перекиси водорода, возникает в возбужденном синглетном состоянии.

Глутатионпероксидаза – фермент, служащий для инактивации перекиси водорода в клетках высших животных. GPO– гликопротеин, имеющий в активном центре четыре атома селена. Он является гидрофильным соединением, что затрудняет его проникновение в липидный слой мембран, основная часть фермента локализована в цитозоле, а остальная – в митохондриях. GPO имеет селеновые изоферменты: внеклеточное GPO, обнаруженная в плазме и молоке, GPO– G1, выделенная из цитозоля клеток печени и кишечника, а также неселеновый изофермент, идентичный GSТ.

«Классическая» GPO представляет собой тетрамер, состоящий из четырех идентичных сферических субъединиц. Каждая субъединица содержит по одному атому селена, на тетрамер имеется два активных GSH-связывающих центра. При уменьшении уровня GPO снижается устойчивость организма к окислительному поражению, что может приводить к развитию свободнорадикальной патологии [Белоусов, Суслова, Трунова, 1998].

GPO катализирует реакцию восстановления глутатионом нестойких органических гидропероксидов, включая гидропероксиды полиненасыщенных жирных кислот, стабильные соединения – оксикислоты:

2GSH + ROOH → GSSG + ROH + H2O

Все GPO, подобно каталазе, способны также утилизировать перекись водорода:

2GSH + H2O2 →GSSG + 2H2O

Также селенсодержащая GPO участвует в обезвреживании пероксинитрита:

2GSH + ONOO- → GSSG + NO + H2O

Сродство GPO к Н2О2 выше, чем у каталазы, поэтому первая более эффективно работает при низких концентрациях перекиси водорода, в то же время в защите клеток окислительного стресса, вызванного высокими концентрациями Н2О2, ключевая роль принадлежит каталазе. В целом же, GPO значительно важнее, чем каталаза, так как каталаза сосредоточена в микросомах, а GPO – в цитозоле и митохондриях, сродство GPO к пероксиду водорода значительно выше, поэтому Н2О2 элиминируется GPO, в некоторых тканях каталаза почти ответствует и GPO играет главную роль в валовом метаболизме Н2О2 [Зубакова, Варакина, Николенко, 1999]. В клетках млекопитающих также обнаружен изофермент GPO, названный «GPO гидроперекисей фосфолипидов». Изофермент помимо Н2О2 и липидных гидроперекисей способен восстанавливать гироперекиси фосфолипидов, он эффективно взаимодействует с гидроперекисями фосфотидилхолина, холестерина и эфира холестерина в мембранах и липопротеинах низкой плотности. Совместно с токоферолом GPO гидроперекисей фосфолипидов практически полностью подавляет ПОЛ в биомембранах.

Активность GPO в живых клетках увеличивается при действии ионизирующей радиации, интоксикации этанолом, акрилонитрилом, при Е-авитаминозе. Особо важна роль GPO в условиях окислительного стресса, так как он предупреждает возникновение и развитие пероксидации, устраняет ее источники и продукты, GPO – является одним из важнейших компонентов ферментативной АОС [Брискин, Рыбакова, 2000].

Глутатион-S-трансфераза входит в семейство ферментов, нейтрализующих токсическое влияние различных гидрофобных и электрофильных соединений путем их коньюгации с восстановленным глутатионом, GST локализованы преимущественно в цитозоле клеток. Основная функция GST-защита клеток от ксенобиотиков и продуктов ПОЛ посредством их восстановления, присоединения к субстрату молекулы глутатиона или нуклеофильного замещения гидрофобных групп:

ROOH + 2GSH → ROH + GSSG + H2O

R + GSH → HRSG

RX + GSH → RSG + HX

GST способны восстанавливать гидроперокси-группы окисленных фосфолипидов непосредственно в мембранах без их предварительного фосфолипидного гидролиза свободными жирными кислотами. Этот фермент конъюгирует с GSН токсичные продукты ПОЛ (ноненали, децинали, холестерин-α-оксид) и тем способствуют их выведению из организма. Таким образом, GST является важным компонентом антиоксидантной защиты, особенно от эндогенных метаболитов, образующих при окислительном стрессе [Владимиров, 1998].

Глутатионредуктаза. Во многих реакциях, катализируемых GPO и GST, две молекулы GST соединяются дисульфидной связью и образуют окисленный глутатион. Для восстановления GSSG в клетках существует специальный фермент – глутатионредуктаза [Зенков, Меньщикова, 2004].

ГР широко распространенный флавиновый фермент, поддерживающий высокую внутриклеточную концентрацию GSH, катализируя обратимое NFDFH– зависимое восстановление GSSG с образованием двух молекул GSH.

GSSG + NADFH + H+ → 2GSH + NADF+

ГР содержится в основном в растворимой части клетки.

Глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа. Для восстановления окисленного глутатиона ГР в качестве донара водорода используется NADFH, который образуется в пентозофосфатном пути в ходе глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной реакции [Андреев, 1999]

G6FD – фермент, катализирующий начальную реакцию пентозофосфатного пути: восстановление глюкозо-6-фосфата в 6-фосфоглюконат. Она состоит из двух типов субъединиц, которые состоят из 479 аминокислотных остатков, имеют один и тот же СООН - концевой участок, но разные NH2-концы, Эти субъединицы различаются по длине и последовательности аминокислот. Реакцию, катализируемую G6FD, с кинетической точки зрения можно рассматривать как двухсубстратную реакцию, протекающую с участием субстрата и кофермента, выполняющего роль второго субстрата. Фермент очень сильно ингибируется NADFH и ATF, по типу конкурентного ингиирования.

Глутатион – трипептид (L-γ-глутамил-L-цистеинилглицин), который при физиологических значениях рН имеет две отрицательно заряженные карбоксильные группы и положительно заряженную аминогруппу.

Наличие γ-глутамильной связи защищает трипептид от деградации внутриклеточными пептидазами, а сульфгидрильная группа цистеина может служить донором электронов, придавая глутатиону свойства восстановителя и способность удалять свободные радикалы. Одноэлектронная реакция GSH со свободными радикалами приводит к образованию тиильного радикала GS., который при димеризации с другим GS. радикалом дает дисульфид глутатиона (GSSG). Второй тип окислительно-восстановительных реакций, в которых принимает участие глутатион - это реакции тиол-дисульфидного обмена [Brune,1995]. При окислительно-восстановительных реакциях третьего типа происходит двухэлектронное окисление с образованием интермедиата, который затем реагирует со второй молекулой, идентичной первой или отличной от нее. При этом в первом случае образуется GSSG, а во втором-смешанный дисульфид.

В клетках всех типов GSH синтезируется в ходе двух последовательных реакций, катализируемых γ-глутамилцистеинсинтетазой (γ-GCS) и GSН-синтетазой (GS). γ-GCS катализирует образование пептидной связи между γ-карбоксильной группой глутамата и α-аминогруппой цистеина. Глутатионсинтетаза образует пептидную связь между α-карбоксильной группой цистеина в составе γ-глутамилцистеина и α-аминогруппой глицина. Обе реакции являются ATF-зависимыми, имеют сходный каталитический механизм и протекают через образование ацилфосфатного интетрмедиата [Davies,1995].

Статус глутатиона определяется как общая концентрация глутатиона и количественное соотношение между различными формами, в которых он существует в клетке. Статус глутатиона обусловлен динамическим равновесием между реакциями синтеза, деградации, транспорта, окисления и восстановления и поэтому может изменяться в зависимости от преобладания тех или иных реакций, что определяется состоянием клетки и окружающей среды. Изменение статуса GSH может наблюдаться как при нормальных физиологических ситуациях, так и при стрессах. Для ингибирования синтеза GSH у эукариот широко используется ингибитор γ-глутамилцистиинсинтетазы [Gebhardt,1984].

Редокс-активность глутатиона при одновременной его устойчивости к окислению кислородом, высокая концентрация и возможность поддержания в восстановленном состоянии делают GSH важнейшим внутриклеточным редокс-буфером. Редокс система глутатиона включает в себя сам глутатион, GPO и ГSТ [Davies,1995].

GSH реагирует с очень большим числом электрофильных компонентов с образованием GSH-конъюгатов. Эта реакция может происходить спонтанно или катализироваться ферментами GSТ, затем коньюгаты деградируют до относительно безвредных меркаптуровых кислот. Глутатион также участвует в детоксикации некоторых реактивных альдегидов, которые могут образовываться при окислительных процессах в клетках. У эукариот глутатион играет ключевую роль в защите от окислительного стресса как кофактор селенозависимых и независимых GPO (Рис. 2). При окислительном стрессе идет интенсивное окисление GSH, и снижение соотношения GSH/GSSG является одним из основных признаков окислительного стресса в клетках [Brune,1995].

Защита живых организмов от окислительных повреждений не ограничивается рассмотренными выше антиоксидантными системами, а осуществляется так же большим количеством репарационных систем, специфическими протеолитическими ферментами; макрофагами и гепатоцитами, эффективно захватывающими окисленные липопротеины через специальные «скэвенджнр-рецепторы». Эта еще раз свидетельствует о важности и сложности окислительных процессов с участием АФК, протекающих в живом организме.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объект исследования

Объектом исследования явились эритроциты крови практически здоровых людей, проживающих в Советском и Октябрьском районах г. Красноярска, а так же эритроциты крови людей с ЛОР-патологиями.

Всего обследовано 131 человек в возрасте от 18 до 54 лет, забор материала исследования проводился в клиническо-диагностической лаборатории ГУ НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН. Группу контроля составили 102 практически здоровых человека, неболевших острыми респираторными заболеваниями в течение последнего месяца и не имеющих хронических ЛОР-заболеваний. Здоровые люди были отобраны в 2-х районах города Красноярска ЛОР-врачом по данным клинического осмотра. Группа людей с ЛОР-заболеваниями составила 29 человек, проживающих в различных районах г. Красноярска.

Таблица 1

Характеристика материала исследования и объёма проведенных работ

Методы исследования

Здоровые

ЛОР-больные

Всего

Определение содержания GSH в эритроцитах крови

Определение активности GPO в эритроцитах крови

Определение активности GST в эритроцитах крови

Определение активности GR в эритроцитах крови

Определение содержания гемоглобина в эритроцитах крови

91

89

90

67

91

29

20

28

6

29

120

109

118

73

120

Всего

428

112

540